根据2021年7月30日希腊最新报道，第四波疫情接踵而至，新冠肺炎确诊人数新增2694例。希腊相关研究学家在担心焦虑的同时，一直在寻找“零号病人”（第一个确诊的流行病患者），也因此发现：希腊各主要城市废水中的新冠病毒载量急剧增加。其实早在2019年3月中旬，在西班牙采集的废水中已经出现了新冠病毒的踪迹，相比西班牙 2020年2月25日曝出第一例本土病例足足早了近一年的时间，这就不得不令人深思。因此，本期推送将重点关注废水中的新冠病毒。
one
废水中的COVID-19病毒
DNA—SARS-CoV-2
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现如今，疫情反反复复，不少的研究者也在寻找能够更有效记录并且控制疫情传播的方法。在调研的过程中，研究者们在废水中发现了一种名为SARS-CoV-2的物质，该物质正是COVID-19病毒的DNA。因为SARS-CoV-2的RNA大多数是从新冠病人的粪便中排出的，所以通过监测废水中的病毒量可以帮助我们更好地管理和控制未来即将出现的新冠疫情。
SARS-CoV-2病毒的结构图
鉴于泰国是继中国之后第一个报告废水里有SARS-CoV-2病毒的国家，并且泰国的新冠病例相对较少，适合量化随机化调查，因此，研究者们将实验地点选在泰国曼谷市市中心和郊区的废水收集中心。2020年7月至12月期间，研究者每月从曼谷市中心和26个郊区的24个实验点随机收集两次废水，再从泰国公共卫生部疾病控制司获取新冠病例数，利用实时聚合酶链反应（PCR）技术对SARS-CoV-2进行量化研究。研究发现，从市中心和郊区收集的废水中都存在SARS-CoV-2病毒，并且从10月到12月浓度在不断增加。废水的SARS-CoV-2病毒数量变化趋势与新冠阳性患者数量变化趋势一致。这一结果表明，废水中SARS-CoV-2病毒数量的增加可能与社区内感染者人数的增加有关。但是，废水中的SARS-CoV-2病毒数量比报告的新冠阳性病例数字高得多，这些高出的病毒数量极有可能与无症状病例有关。因此，可以将废水监测作为早期预警系统。
虽然每位患者的粪便脱落强度和持续时间存在差异，加之患者每日在市中心和郊区之间通勤可能也会影响不同实验点的结果，但是研究结果显示市中心和郊区废水中的SARS-CoV-2病毒数量并没有明显差异。此次研究结果意味着废水监测有利于检测新冠病毒。因此，监测废水中的SARS-CoV-2病毒对了解疾病传播动态有重大的帮助。
参考文献
Dhammika Leshan Wannigama. etc. Tracking COVID-19 with wastewater to understand asymptomatic transmission. [J] International Journal of Infectious Diseases, 2021, 108:296-299.
two
检测废水中的SARS-CoV-2
多重PCR检测法
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一些研究表明，监测废水中的SARS-CoV-2病毒可作为临床诊断和COVID-19局部疫情预警系统的补充方法。针对废水样品中SARS-CoV-2病毒检测，研究者们设计了一种基于多重反转录定量的多重聚合酶链反应（PCR）检测法。实验室和现场工作结果都表明，本次研究中研发的多重 PCR 检测法与单一PCR检测法一样稳健，且速度更快，成本效益更高。研究者们在当地污水处理厂收集了四个SARS-CoV-2的环境样本。研究结果表明，四个水样中都存在SARS-CoV-2，并且在2月份呈上升趋势，这些结果证实了多重PCR检测法的科学性，也凸显了它的稳健性及其在样本分析中的适用性。
目前采用的多重PCR检测法主要依靠定量PCR（qPCR）和反转录qPCR（RT-qPCR）进行。使用其他不同的检测方法、引物和探针时，SARS-CoV-2病毒不同的基因检测率有所不同，而多重PCR的方法可以同时检测和量化一个样品中的多个SARS-CoV-2病毒基因目标。因此，我们可以用较少的样品量获得更多的信息。它不仅能节省时间，也减少了试剂的用量，更具有成本效益。此外，它也能最大限度地减少因转移废液而产生病毒变异的可能性。然而，因其检测过程较为复杂，多重PCR检测仍需要优化，以避免引物/探针组之间的相互作用和针对不同基因的检测试剂之间的恶性竞争。
如今，尽管SARS-CoV-2病毒数量与流行病学案例之间的相关性尚未建立，但是监测水域病毒有助于了解病毒在人群中的动态变化趋势，并且可以提高疫情遏制的效率。而多重PCR检测方法的运用，更从成本、效率等方面提高了研究成果的准确性和完整性。
Anna Navarro. etc. SARS-CoV-2 detection in wastewater using multiplex quantitative PCR. [J] Science of the Total Environment, 2021, 797:1-8.
3
three
SARS-CoV-2失活的指标
体细胞大肠杆菌噬菌体
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污水处理厂每天会处理大量的污水淤泥，或通过焚烧或用作肥料，将处理后的污水淤泥重新应用到农业领域。然而，原污泥含有大量高度多样化的病原微生物，如寄生虫、细菌和病毒，污水处理采用的处理方法主要针对肠道病毒（肠道病毒是直径在20-90纳米间的小病毒，其基因组仅由蛋白壳保护。它们在人类肠道中复制，引起如胃肠炎、肝炎、脑膜炎、心脏损伤等病症）。已有研究在废水中发现高浓度的SARS-CoV-2基因组、甚至在污泥中发现了更高浓度的SARS-CoV-2基因组。因此，在疫情期间，我们需要对土地污泥处置方法进行风险评估，将其分为直接接触、气溶胶和生态传播三个等级。由于气溶胶是主要的传播方式之一，因此我们需要尤为慎重。
研究发现：随时间推移，传染性体细胞大肠杆菌在原废水中相对稳定，但是其浓度即使在疫情最严重的情况下，也比传染性SARS-CoV-2的浓度高得多。原废水中传染性SARS-CoV-2的浓度可能大大低于SARS-CoV-2基因组或传染性体细胞胶体的浓度。尽管感染性病毒的存活率可能很低，但鉴于我们目前的知识水平，我们不能完全排除原废水中存在感染性SARS-CoV-2的可能性。由于SARS-CoV-2在20℃下几天内就会迅速失去感染性，而污泥的储存期从几周到几个月不等，因此储存的污泥中存在传染性的SARS-CoV-2的可能性很低。检测体细胞大肠杆菌是一个简单、广泛存在且较为便宜的替代方法，能够验证SARS-CoV-2病毒的活性。
假设传染性SARS-CoV-2可以存在于初级污泥中，我们可以采取两种方法来减少体细胞大肠杆菌——基于热度和pH值的处理。在pH值处理中，SARS-CoV-2和体细胞大肠杆菌反应相似：在pH值低于11，室温下暴露不足10分钟的情况下，几乎都没有观察到灭活现象；在pH值为11及以上时，体细胞大肠杆菌和SARS-CoV-2的下降幅度分别为1-log10和超过5-log10。另外，实验者们也观察到了pH值和温度之间的协同效应：在pH值为9时，猪流行性腹泻病毒(一种冠状病毒)在40℃时的T90值约为27分钟，44℃时为18分钟，48℃时为4分钟。在pH值为10.2时，T90值分别约为14、8和1分钟。阻止细胞受体识别的病毒包膜蛋白可能在碱性pH值下发生了的一些不可逆的构象变化。
研究结果表明，体细胞大肠杆菌是SARS-CoV-2灭活的高度保守的指标。可以去除或减少传染性体细胞大肠杆菌噬菌体的处理方法（基于热度和pH值）被认为可以有效治疗传染性 SARS-CoV-2病毒。如果污泥中仍然存在任何传染性SARS-CoV-2，通过加热或pH值处理等常用的污泥处理的方法，可以有效消除传染性SARS-CoV-2颗粒。
参考文献
M. Varbanov. etc. Somatic coliphages are conservative indicators of SARS-CoV-2 inactivation during heat and alkaline pH treatments.[J].Science of the Total Environment: 797 (2021) 149112
消除废水中的SARS-CoV-2
污水三级处理法
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COVID-19能够诱发呼吸道感染，引起如发烧、恶心、呕吐、腹泻等症状。感染者的呼吸道、血液和粪便中也能检测到SARS-CoV-2的RNA，粪便脱落后，废水中将出现病毒遗传物质。
基于废水的流行病学方法（wastewater-based epidemiology，2020）可以通过测量废水中的SARS-CoV-2 RNA，为特定地区提供有关COVID-19流行趋势的有用信息。在不同地区废水中出现的SARS-CoV-2 RNA与COVID-19发病率紧密相关。此外，研究人员在COVID-19第一例病例报告前收集的废水样本中检测到SARS-CoV-2 RNA，凸显了SARS-CoV-2污水监测作为早期预警系统的潜力。
尽管Westhaus等人（2021）进行的初步研究表明，废水不太可能成为SARS-CoV-2向人类传播的主要途径，但仍然有两项流行病学研究认为SARS-CoV-2可能通过粪便传播。研究人员为了解废水处理的作用，如消除SARS-CoV-2的RNA、保护经处理的水体，进行了一系列研究，报告了西班牙和法国16个污水处理厂是否有SARS-CoV-2 RNA出现及出现的浓度。这些数据显示了各种方法在消除SARS-CoV-2 RNA方面的效率。研究发现：污水处理厂中SARS-CoV-2 RNA明显减少。然而，一级和二级处理并不能完全去除SARS-CoV-2 RNA，经过三级的MBR和氯化处理后，SARS-CoV-2 RNA再没有被检测到。因此，一级和二级处理的污泥以及浓缩和厌氧消化处理，都不能有效地消除污泥中的SARS-CoV-2 RNA。只有经过三级处理后，SARS-CoV-2 RNA才消失。
在分析的样品（废水和污泥）中存在病毒RNA并不意味着它们感染性或完整性。需要进一步的研究来估计二级处理后的废水以及污泥浓缩和消化后的病毒感染状态，以验证是否需要额外的处理来保护环境。最后，F-特异性RNA噬菌体在进水中浓度高。我们可以把这些病毒当作合适的指标，以确定病毒减少与否。然而，我们还需要进一步研究噬菌体的潜力，以确定噬菌体是否能在水和污泥处理中作为衡量SARS-CoV-2的指标。
污水三级处理过程中的两项数据变化
（A：新冠阳性样本的占比；B: SARS-CoV-2病毒RNA进水浓度与出水浓度之比）
参考文献
Albert Serra-Compte. etc. Elimination of SARS-CoV-2 Along Wastewater and Sludge Treatment Processes.[J] Water Research. 202 (2021) 117435
END
废水，特别是那些未经处理的废水，可能会使公众面临被感染的危险。在COVID-19的大流行背景下，减少新冠病毒对人类健康和自然的危害至关重要。自古以来，我们人类就是在水的滋养下生存和繁衍，今后同样要依赖与水资源而继续存在和发展。所以无论如何，我们都不可以以环境的恶化为代价换取一时的经济发展，因为那将造成人类无法承受的恶果，并最终导致一切人类文明化为乌有。
撰稿：唐澜 杨昕妤 李佳艺 郭越
排版：郭越
初审：马世昕 刘禹鸶
终审：高霄 储艳 郭喆 金叶 贺梵
