近期，我校生物工程学院穆晓清教授和聂尧教授课题组在胺脱氢酶底物特异性改造及催化合成N-杂环胺方面取得重要进展，研究成果“Unlocking the Substrate Acceptance of Phenylalanine Amine Dehydrogenase Enables the Asymmetric Synthesis of Pharmaceutical N-Heterocyclic Primary Amines”发表于ACS Catalysis (IF = 11.3) (https://doi.org/10.1021/acscatal.4c06478)。
含氮结构基序，包括手性氨基和氮杂环是药物活性成分中的关键组分，同时含有这两种结构基序的手性氮杂环胺是众多重磅药物的构建砌块和合成中间体（图1）。因此，开发绿色、可用、高效的手性氮杂环胺不对称合成的生物催化剂是当前手性胺类化合物合成领域的中心主题之一。胺脱氢酶属于NAD（P）H辅因子依赖型氧化还原酶，其催化的潜手性羰基化合物的不对称还原胺化反应具有以廉价无机氨为氨基供体、副产物仅为水，符合当前强调的绿色制造理念和可持续发展特征，在手性胺类化合物的生物合成中极具吸引力。原则上，胺脱氢酶催化的原料易得氮杂环酮的不对称还原胺化为手性氮杂环胺的制备提供了一种直接简便的方法。然而，目前报道的胺脱氢酶数量少，底物范围有限，尚未见基于胺脱氢酶催化不对称还原胺化制备手性氮杂环胺的案例。
图1
在此背景下，研究人员基于其以往在胺脱氢酶底物识别机制解析及底物接受度改造策略开发方面的工作（ACS Catalysis. 2023; 13: 158-168（见往期推荐：江南大学穆晓清/聂尧组ACS Catalysis｜重塑亮氨酸脱氢酶底物结合口袋以双向催化结构多样性底物)、ACS Catalysis. 2024; 14: 2685-2695-封面论文、Chemical Engineering Journal. 2024; 490: 141735），选择N-Boc-3-哌啶酮作为本研究中胺脱氢酶催化的氮杂环酮模型底物，通过基于逆行底物设计策略的起始底物筛选，对模型底物进行结构拆解，选择小尺寸的N-Boc-3-乙酸甲酯作为底物接受度改造的起始底物，并以起始底物的催化活性为筛选指标，从实验室建立的小型胺脱氢酶文库中筛选出源于栗褐芽孢杆菌（Bacillus badius）的苯丙氨酸胺脱氢酶（F-BbAmDH）作为目标氮杂环酮底物接受度改造的出发酶。随后，进一步通过基于结构指导的底物结合口袋空间位阻突变对F-BbAmDH进行底物接受度进化，获得的单点突变体V144A成功产生了模型底物N-Boc-3-哌啶酮的底物特异性，额外的两轮迭代位点组合突变构建的三点突变体V144A/V309G/L306V对模型底物N-Boc-3-哌啶酮的催化活性较单点突变体V144A提高了143.4倍（图2）。
图2
制备规模合成表明突变体V144A/V309G/L306V具有显著扩展的目标氮杂环酮底物范围，可催化一系列结构多样的N-Boc取代的氮杂环酮的不对称还原胺化，从而制备相应的高附加值手性氮杂环胺，且突变体维持了优异的立体选择性，所有产物ee值均>99%（图3）。基于酶-底物复合物结构特征的计算分析为突变体催化氮杂环酮底物特异性的来源和催化活性的改善提供了详细的分子见解（图4）。
图3
图4
该研究首次报道了基于胺脱氢酶催化不对称生物合成制备此类手性氮杂环胺，为高附加值手性氮杂环胺药物构建砌块的生物催化绿色合成奠定了基础，并为胺脱氢酶家族成员及具有类似底物结合口袋的氧化还原酶的底物接受度的分子改造提供了可参考的工程指导。
江南大学穆晓清教授和淮阴师范学院许家兴教授为共同通讯作者，江南大学聂尧教授为共同作者，原江南大学生物工程学院2020级博士研究生、现淮阴师范学院化学化工学院青年教师吴涛为论文第一作者。本项工作得到国家重点研发计划项目（2021YFC2100100）和国家自然科学基金（U22A20426、22078122）等项目的资助。
