数字PCR（dPCR）作为第三代PCR，已经成为临床诊断的重要手段，与实时荧光定量PCR相比，dPCR可以提高每个反应容器中DNA分子的浓度和对样品中抑制剂的耐受性，并在定量方面也表现出更高的灵敏度。然而，目前dPCR的目标物检测数量受到荧光通道数的限制，每个荧光通道内只能检测一个目标。现存的单通道多重dPCR方法主要是通过调节荧光通道内不同目标物的荧光强度进行区分和定量。然而，该方法由于dPCR中的“雨滴”现象（即一些阳性微孔的荧光强度较低，难以和其他目标物区分）限制了其分类表现。因此需要开发更准确的单通道多重dPCR的新方法。而深度学习作为一个可以充分提取图像特征的工具，无疑为单通道多重dPCR的实现提供了新思路。
基于多重dPCR的现状，西安交通大学仿生工程与生物力学研究所（BEBC）的研究人员开发了基于深度学习图像分析的多重dPCR近似颜色分析方法（SCAD），摆脱了“雨滴”现象的干扰，实现了单一荧光通道下的多重目标物的区分，并对深度学习模型所学习的特征进行了解释（图1）。
图1 单个荧光通道中基于 SCAD 的多重 dPCR 概述
该工作选取碳青霉烯酶相关基因blaNDM和blaVIM作为检测目标序列，并用两种发射光相近的绿色荧光染料Alexa Fluor 488（AF488）和tetrachloro fluorescein（TET）做荧光标记。首先，该工作对这两种目标物的反应结果进行了统计分析和初步的聚类分析（图2）。由于“雨滴”现象的存在，不同目标物的微孔的荧光强度存在较大的重叠，难以只靠荧光强度进行区分，而机器学习聚类方法可以实现对不同目标物的初步分类。
图2 两种目标物的统计学分析和聚类图谱
为了进一步实现分类，该工作使用了深度学习模型Vision Transformer（ViT），并引入了Flowformer的注意力机制降低ViT复杂度，完成了对不同目标物微孔的高精度分类，其预测未知数据的准确率可达98.51%（图3）。此外，该工作分析了每个微孔内部的荧光强度的空间分布规律，结合ViT的attention map对模型学习特征进行了解释：模型可以学习不同目标物微孔内部的荧光强度、分布以及微弱颜色区别来进行分类。
图3 使用ViT对不同目标基因进行分类
最后，训练后的模型在实际多重dPCR检测中表现出良好的预测能力和精确的量化，证实了SCAD方法可以在无特殊设备辅助的情况下，能够进一步扩大多重dPCR的多重检测通量。（图4）
图4 SCAD多重dPCR检测定量结果
该成果以“Similar color analysis based on deep learning (SCAD) for multiplex digital PCR via a single fluorescent channel”为题发表在英国皇家化学会旗下Lab on a chip期刊。文章第一作者为BEBC博士研究生曹超羽，通讯作者为游民黎助理教授和徐峰教授。其他作者包括BEBC研究生佟昊阳、薛真睿、刘畅、贺望虹、彭萍等。该工作得到了陆军军医大学姚春艳教授、西安交通大学口腔医学院李昂教授和BEBC许夏瑜副教授的倾力支持，也得到BEBC老师和同学们的大力协助，以及国家重点研发计划、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划和陕西省自然科学基金等项目的资助。
论文信息
Similar color analysis based on deep learning (SCAD) for multiplex digital PCR via a single fluorescent channel
Chaoyu Cao（曹超羽），Minli You（游民黎）*，Haoyang Tong（佟昊阳），Zhenrui Xue（薛真睿），Chang Liu（刘畅），Wanghong He（贺望虹），Ping Peng（彭萍），Chunyan Yao（姚春艳），Ang Li（李昂），Xiayu Xu（许夏瑜），Feng Xu（徐峰）*
Lab on Chip 2022
原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/lc/d2lc00637e
