本文介绍的是厦门大学柔性电子（未来技术）研究院李林教授课题组通过理性设计新型α-酮酰胺基反应性的双光子探针，并用于可视化帕金森病模型中的过氧亚硝酸盐研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第4期。

A novelα-ketoamide reactivity-based two-photon fluorogenic probe for visualizing peroxynitrite in Parkinson's disease models

新型α-酮酰胺基反应性的双光子荧光探针用于可视化帕金森病模型中的过氧亚硝酸盐

Tao Shao, Xianning Xu,Lan Wang,Yu Shen, Jun Zhao, Huizi Li, Duoteng Zhang, Wei Du, Hua Bai, Bo Peng and Lin Li

研究背景

帕金森病（PD）是第二大常见的神经退行性疾病。线粒体功能障碍与氧化应激是PD的重要发病机制，线粒体功能障碍导致的ROS大量产生在多巴胺能神经元的死亡过程中扮演重要角色。PD病理条件下，中枢神经系统中的一氧化氮合成酶产生过量的NO，与线粒体损伤过程中产生的过量O₂^•−迅速反应，生成过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）。ONOO⁻具有较强的氧化性和亲核性，可氧化攻击核酸、脂质和蛋白质等生命大分子，导致细胞死亡。由于ONOO⁻的生物水平低、稳定性差、半衰期短，快速、准确检测生物系统中的ONOO⁻具有很大的挑战。双光子荧光成像作为一种非侵入性和背景干扰低的成像技术，是监测复杂生物系统中ONOO⁻水平的理想方法。因此，开发一种新型的双光子探针用于可视化PD模型中的ONOO⁻具有重要意义。α-酮酰胺是经典的ONOO⁻识别基团，但是基于α-酮酰胺基反应性的双光子荧光探针在PD模型中追踪ONOO⁻波动尚未报道。此外，现有α-酮酰胺的ONOO⁻荧光探针大多通过含有吸电子取代基(NO₂或CN)的芳基二羰基来提高反应活性，然而随着反应活性的增加，其他活性氧物质可能会干扰ONOO⁻的选择性检测，包括H₂O₂和ClO⁻。因此，开发新型α-酮酰胺基反应性的双光子荧光探针用于可视化PD模型中的ONOO⁻仍面临挑战。

内容简介

本研究选择能够特异性响应ONOO⁻的基团α-酮酰胺作为识别基团，萘环结构作为荧光团合成荧光探针。体内外结果表明，荧光探针DFlu具有优异的灵敏度、选择性、稳定性及生物相容性，并且能够成功应用于可视化多种神经毒素诱导的PD模型（包括细胞、斑马鱼）中ONOO⁻的水平波动。因此，该探针不仅能够在复杂的生理病理系统中检测到ONOO⁻水平的波动，更重要的是有望为ONOO⁻相关疾病的早期诊断提供一种快速、有效的检测工具。

图文导读

1.理性设计合成及表征

图1：ONOO⁻探针DFlu和SFlu的合成路线

将α-酮酰胺与N-甲基氨基乙酰萘（Flu）通过草酰氯的酰胺化反应生成ONOO⁻探针DFlu和SFlu，一方面Flu具有优异的双光子活性，识别后释放Flu可保证其双子光子荧光性质；另一方面通过乙酰基萘可以削弱其反应活性，有助于实现ONOO⁻专一性检测。并对所获得探针进行了全面的表征，确定了其结构与设计一致。

2.探针在溶液中识别ONOO⁻的光物理性质变化

图2：(a)DFlu(10μM)对不同浓度ONOO⁻(λex = 350 nm)的吸收光谱和(b)荧光光谱。(c)SFlu(10μM)在不同浓度ONOO⁻(λex = 365 nm)下的吸收光谱和(d)荧光光谱。(e)不同浓度ONOO⁻在490 nm处的发射强度变化。在0-3000 nM范围内加入不同浓度ONOO⁻的荧光强度线性拟合曲线。λex = 350 nm。(f)在60 s时加入10-50μM ONOO⁻，490 nm处的荧光强度随时间的变化

如图2所示，两种ONOO⁻探针DFlu和SFlu均可以识别ONOO⁻。其中DFlu识别ONOO⁻后，表现出荧光“开启”行为，并且响应时间较短。因此，接下来我们选择了DFlu进一步评估其识别ONOO⁻的专一性、抗干扰能力。

3.识别ONOO⁻的专一性、抗干扰能力及稳定性

图3：(a)DFlu对各种物质的荧光响应。1-29:空白; ONOO⁻; ROO⁻;¹O₂;·OH; ClO⁻; H₂O₂; Mg²⁺; Al³⁺; Cu²⁺; Fe³⁺; Mn²⁺; Zn²⁺; Ni²⁺; HCO³⁻; F⁻; I⁻; Br⁻; NO₃⁻; CO₃⁻; SO₄²⁻;甘氨酸;丙氨酸;缬氨酸;蛋氨酸;脯氨酸;丝氨酸;酪氨酸;组氨酸。(b)在28种物质存在下，DFlu与ONOO⁻反应的荧光强度。λex = 350 nm，λem = 490 nm;(c)DFlu与空白、H₂O₂(100µM)、H₂O₂(500µM)、ONOO⁻(40µM)孵育后的荧光响应和(d)柱图。不同（e）温度与（f）pH中，DFlu与ONOO⁻反应前后的荧光强度

在常见生物系统中所蕴含的阳离子、阴离子及氨基酸的存在下，探针表现出稳定的专一性及抗干扰能力；另外得益于反应活性的降低，探针对ONOO⁻类似物H₂O₂表现超高的化学惰性，即使在较高浓度的H₂O₂存在下，也不会干扰探针特异性识别ONOO⁻。且探针在生理环境下（温度和pH）也表现出较高的稳定性。

4.识别机制研究

图4：（a)DFlu与ONOO⁻反应30 min的HPLC变化。(b)DFlu和Flu的理论TDDFT吸收峰。(c) 加入ONOO⁻前后DFlu的吸收峰变化。(d)DFlu和Flu的结构和DFT优化的前线分子轨道

通过高效液相色谱、紫外-可见吸收光谱结合理论计算结果表明：探针DFlu识别ONOO⁻后，可释放Flu，恢复Flu分子内电荷转移（ICT)能力，表现出强烈的荧光信号，这与我们设计思想一致。

5.DFlu检测细胞外源性及PD细胞模型中的ONOO⁻水平

图5：SH-SY5Y细胞外源性ONOO⁻的（a）共聚焦显微成像及（b）荧光强度量化图（n = 3，λex = 405 nm，λem = 500-570 nm，*P < 0.05 vs control，^#P< 0.05 vs SIN-1）；MPP⁺诱导SH-SY5Y细胞帕金森病模型中内源性ONOO⁻的（c）共聚焦显微成像及（d）荧光强度量化图（n = 3，λex = 405 nm，λem = 500-570 nm，*P < 0.05 vs control，^#P< 0.05 vs MPP⁺）

如图5所示，一方面，应用10μMDFlu检测SH-SY5Y细胞中的外源性ONOO⁻水平。利用SIN-1处理SH-SY5Y细胞后，DFlu检测发现，与对照组细胞相比，荧光信号显著增强，经过 ONOO⁻清除剂UA进一步处理后，荧光信号降低。另一方面，利用MPP⁺刺激SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型，在荧光成像系统中应用DFlu检测ONOO⁻信号变化。对照组细胞几乎无荧光信号，MPP⁺刺激后荧光信号显著增强，相比对照组增加了约6倍，ONOO⁻清除剂UA进一步处理后，荧光强度显著降低。以上结果证明，DFlu适用于评估细胞水平的ONOO⁻通量变化，依从性好，灵敏度高，能够成功用于可视化检测PD细胞模型中的ONOO⁻水平变化。

6.DFlu检测斑马鱼中外源性及PD模型ONOO⁻水平

图6：斑马鱼外源性ONOO⁻的（a）双光子共聚焦显微成像及（b）荧光强度量化图（n = 3，λex = 760 nm，λem = 420-500 nm，*P < 0.05 vs control，^#P < 0.05 vs SIN-1）；MPP⁺诱导斑马鱼帕金森病模型内源性ONOO⁻的（c）双光子共聚焦显微成像及（d）荧光强度量化图（n = 3，λex = 760 nm，λem = 420-500 nm，*P < 0.05 vs control，^#P < 0.05 vs MPP⁺）

在细胞水平证明了DFlu具有可视化评估ONOO⁻通量的能力后，基于Flu的双光子诱导荧光的性质，我们进一步将其应用于活体内ONOO⁻信号变化的研究。如图6，双光子激光共聚焦成像结果显示，与对照组斑马鱼相比，SIN-1处理之后的斑马鱼荧光强度增强了将近7倍，UA进一步处理后，荧光信号与SIN-1组相比显著降低。结果表明SIN-1处理能显著增加斑马鱼活体内的ONOO⁻水平，DFlu能特异性检测出SIN-1诱导的ONOO⁻升高及UA引起的ONOO⁻降低，可实现活体内ONOO⁻变化的灵敏检测。最后，我们将DFlu探针应用于MPP⁺构建的斑马鱼PD模型中。对照组斑马鱼荧光信号较弱，MPP⁺刺激后，荧光信号增强，与对照组相比增加了将近5倍，叠加UA处理后，荧光信号减弱。结果表明DFlu能准确指示斑马鱼PD模型中的ONOO⁻通量变化。

通讯作者简介

李林，厦门大学柔性电子（未来技术）研究院教授，博导。课题组主要关注交叉学科范畴的“线粒体信息与健康工程”研究。研究成果在活体层面上揭示了人工合成分子工具在线粒体质量控制中的作用，同时在基因水平上阐述了该类合成分子生物功能调节剂在疾病诊断、信号转导和药物开发等健康科学领域的应用前景。迄今为止，在Nature Communications、Journal of the American Chemical Society、Angewandte Chemie International Edition、Advanced Materials等期刊上累计发表论文280余篇，申请/授权专利52/25项，参与编撰专著《分子影像与精准诊断》一本。主持国家自然科学基金面上两项和青年项目一项，陕西省自然科学基金重点研发项目和面上项目各一项，企业委托项目六项。